当前KRASG12C(关闭) 针对非活性GDP约束KRAS的抑制剂G12C在不到一半的患者中引起反应，这些反应不持久。一类RASG12C(ON) 靶向活性GTP结合KRAS的抑制剂G12C阻断ERK信号比失活状态抑制剂更有效。对任一类试剂的敏感性与mTORC1活性的抑制密切相关。我们以前已经证明PI3K/mTOR和ERK信号传导途径在关键的细胞过程中汇聚，并且抑制这两种途径对于抑制这些过程和显着的抗肿瘤活性是必需的。我们在这里发现KRAS的组合G12C具有选择性mTORC1激酶抑制剂的抑制剂导致细胞周期蛋白D1表达和帽依赖性翻译的协同抑制。此外，KRAS上调了BIMG12CmTORC1抑制剂对MCL-1表达的抑制和抑制都是诱导显著细胞死亡所必需的。在体内，这种组合引起深度、持久的肿瘤消退并且耐受性良好。这项研究表明，ERK和PI3K/mTOR途径各自减轻了对方的抑制作用，并且组合抑制是治疗KRAS的潜在策略。G12C-依赖性肺癌。
导言在20-30% 的非小细胞肺癌 (NSCLC) 中检测到KRAS的致癌突变体，其中
KRASG12C是最常见的变异
1,
2。KRAS是在无活性 [二磷酸鸟苷 (GDP) 结合] 状态和活性 [三磷酸鸟苷 (GTP) 结合] 状态之间循环的GTP酶。最近，已经开发了与GDP结合的KRAS的开关II口袋内的半胱氨酸12共价结合的小分子。G12C
3,
4,
5阻断鸟嘌呤-核苷酸交换因子 (GEF) SOS的结合，导致活化的GTP结合的KRAS水平降低G12C 6。RAS活动缓慢下降，作为KRAS的函数G12CGTPase活性
6。在临床试验中，非活动状态的KRASG12C突变特异性抑制剂adagrasib (MRTX849) 和sotorasib (AMG510) 在开始治疗后6-12个月出现疾病进展的NSCLC患者中获得了37-43% 的抗肿瘤反应率
7,
8,
9。已经确定了多种获得性耐药机制，这些机制主要集中在RAS途径的重新激活上，或者激活平行的信号通路，例如PI3K/mTOR途径。
10,
11,
12,
13,
14。改善和持久的疗效将需要更有效的抑制剂和/或联合疗法来解决对KRAS的耐药性G12C抑制剂或与KRAS协同作用的G12C抑制减缓肿瘤生长并增强细胞死亡。我们先前已经证明，MEK和AKT的联合抑制会减弱KRAS肿瘤的生长，并且这取决于4E-BP1磷酸化的抑制。
15。
在这里，我们展示了KRASG12C抑制与ERK信号的有效抑制有关，但与PI3K/mTOR信号的有效抑制和可变抑制有关，并且肿瘤细胞系对KRAS的敏感性G12C抑制与它们抑制mTOR底物磷酸化的能力密切相关。组合一个KRASG12C抑制剂与PI3K、AKT或mTOR的抑制剂在体外引起细胞生长的协同抑制和细胞凋亡的诱导，其中mTORC1-selective激酶抑制剂是最有活性的。在突变KRAS的异种移植模型中G12C-体内依赖性NSCLC，结合KRASG12C抑制剂与mTORC1-selective激酶抑制剂在耐受剂量下引起协同持久和深部肿瘤消退。我们发现，观察到的组合抗肿瘤活性的机制基础依赖于两个途径的同时抑制，其收敛于几个关键过程，包括细胞周期蛋白D1表达，帽依赖性翻译，和抗凋亡网络，导致协同抑制增殖和诱导凋亡。
结果活动状态KRASG12C抑制剂比无活性状态的KRAS更有效和持久地抑制ERK途径输出G12C抑制剂KRAS的药理抑制作用G12C在NSCLC细胞系中，首先用三种非活性状态的KRAS进行了研究G12C抑制剂，sotorasib
16,adagrasib
17和AZD8037
18。孵育4 °h后，AZD8037抑制KRAS中浓度在100 °nm和1000 °nm之间的ERK磷酸化 (pERK)G12CNSCLC细胞系H358和H23，但不影响KRAS中的pERKG12SA549肺癌细胞系 (补充图。
1a)。孵育12个KRAS后评估细胞活力G12C不同浓度的sotorasib、adagrasib或AZD8037持续72小时的非小细胞肺癌细胞系 (图。
1a)。在1 µ m时，细胞系对KRAS的敏感性G12C抑制是可变的，但每个细胞系对所有三种化合物的反应相似。
KRAS的细胞活力数据G12C用 (处理后的突变细胞系a) 非活动状态KRASG12C抑制剂或 (b) 激活状态KRASG12C72小时的抑制剂。数据是以下各项的平均值 ± SDn = 8个实验重复。c将LU65和H23细胞系用100 ° nmadagrasib或100 ° RM-018处理指定的时间，并通过免疫印迹分析裂解物。平行地，通过RAS-GTP下拉测定测定活性GTP结合的KRAS的量。d在100 °nmadagrasib或100 °nm RM-018处理指定时间后，通过定量PCR在LU65和H23细胞系中确定指定靶基因的mRNA表达。显示的数据代表的是n = 3个实验重复。P显示了值，并通过双面计算t测试。
我们询问这些观察到的敏感性差异是否反映了RAS信号抑制的效力或持续时间的差异。为此，我们使用了一类活动状态的RASG12C包括临床前工具化合物RM-018和RMC-4998的抑制剂，后者更有效并在体内表现出口服生物利用度
13,
19。这些临床前工具化合物是目前处于早期临床试验中的研究性药物RMC-6291的代表。这些化合物与亲环蛋白a和GTP结合的KRAS形成高亲和力的三复合物G12C,然后形成共价键，阻断与下游效应物的结合。KRAS的抑制率G12C通过非活动状态KRASG12C抑制剂由突变体的gtp酶活性决定。相比之下，RM-018和RMC-4998直接与GTP结合的KRAS结合。G12C这会导致更快速和持续的抑制
19。RM-018抑制KRAS中的ERK和PI3K/AKT/mTOR信号传导G12C细胞系LU65和H23以浓度依赖性方式引起KRAS的迁移率变化，表明共价结合 (补充图。
1b)。相比之下，RM-018对ERK抑制或A549的细胞生长几乎没有或没有影响，KRASG12S突变的NSCLC细胞系或PC-9具有EGFR突变和KRAS的NSCLC细胞系重量,与该抑制剂对KRAS的特异性一致G12C(补充图。
1c, d)。
在KRAS小组中进一步评估了RM-018和RMC-4998的影响G12C细胞系。H358、LU65和H2122细胞对RM-018最敏感，IC50值比adagrasib低10倍以上 (图。
1b)。然而，那些对非活性状态KRAS最具抗性的细胞系G12C诸如LU99A和SW1573的抑制剂对RM-018保持相对抗性。RMC-4998在该组细胞系中具有与RM-018相似的抑制模式，但IC50值低约10倍，反映出其效力增加 (图。
1b)。直接比较非活动状态和活动状态KRAS的效果G12C在LU65和H23细胞系中，将RM-018对ERK信号传导的影响与adagrasib进行比较。与作用机制一致，100 ° nm adagrasib在治疗2-4 ° h后最大限度地抑制了ERK信号，而RM-018在治疗1小时后就导致免疫印迹上的pERK信号消失 (图。
1c)。RM-018还比adagrasib更持久地抑制ERK信号，在孵育24和48 °h时pERK信号的再激活较少 (图。
1c)。
为了更全面地量化输出和途径再激活，我们评估了这些抑制剂对ERK途径转录输出的影响。
20。ERK磷酸化不随输出线性变化，因为ERK磷酸酶DUSP1、4和6的表达是ERK依赖性的。我们使用PCR来确定KRAS的影响G12C9种ERK调节的mrna表达的抑制剂作为时间的函数 (图。
1d)。Mrna编码由ERK信号传导调节的途径激活和反馈以及转录因子。基于途径抑制后表达的动态范围和它们相对短的半衰期来选择它们，这将允许在24 °h进行评估。
两种类型的化合物在4 °h均显着抑制每种mrna的表达，但在每种情况下，RM-018都比adagrasib有效得多 (图
1d)。此外，尽管在用adagrasib处理的H23细胞中，在8/9 mrna的24？H发生了显着的表达反弹，而在用RM-018处理的H23细胞中，反弹仅发生在3/9 mrna中，并且水平低于adagrasib。在LU65中，RM-018的初始作用远大于adagrasib，并且在24 °h时，7种mrna的表达小于基线的10%，而在adagrasib处理的细胞中只有2种mrna是这种情况。这些结果与通过免疫印迹获得的结果一致，并清楚地表明活跃状态的RASG12C抑制剂RM-018比非活动状态的KRAS更有效，更不容易发生后期反弹G12C抑制剂。然而，尽管RM-018对ERK途径的抑制作用更强，更持久，但在KRAS组中反应的异质性仍然很明显。G12C细胞系。
为了研究影响RAS抑制敏感性的其他变量，非活动状态KRAS的影响G12C在细胞系组中评估RAS、RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信号传导的效应通路上的抑制剂AZD8037。为了便于比较，与对照相比，在1 µ m AZD8037下活细胞少于50% 的细胞系被归类为敏感的，而那些超过75% 存活的被归类为耐药，而介于两者之间的被归类为中间 (图。
1a)。用AZD8037处理2小时后，在所有12个测试细胞系中pERK都被显著抑制 (图。
2a)。在大多数情况下，抑制持续至少24 °h，没有或只有轻微的反弹。在5个细胞系 (HOP62、H1792、HCC44、SW1573、LU99) 中，在24 °h发生显著的反弹。其中，两个是抗性的，三个是中间的，表明ERK抑制的持久性与敏感性有关。然而，在具有中等敏感性的其他细胞系 (H23，H1373，H2030，Calu1) 中，ERK在24 °h仍被有效抑制，这表明其他变量在确定敏感性中起作用。
aKRAS的免疫印迹G12C用1 μ m AZD8037处理指定时间的突变细胞系。KRAS细胞活力的散点图G12C72小时处理后的突变细胞系针对24小时处理后的相应总蛋白标准化的所示磷酸化蛋白的定量免疫印迹强度作图。该图显示了12个细胞系，每个细胞系用1 μ m Sotorasib或1 μ m azd8037进行两次独立实验。右2通过线性回归计算。c与 (相同b)，但12个细胞系在用100 μ nm RM-018处理后各绘制一次。d细胞活力与KRAS对照的百分比变化G12C突变细胞系用BYL719 1 µ m，MK2206 1 µ m，雷帕霉素10 nM，RMC-6272 1 nM，RapaLink-1 10 nM，Adagrasib 100 nM，RM-018 100 nM，或所示的组合治疗。每个点代表的平均值n = 8个实验重复，并且方框表示细胞系的平均值。e细胞活力与KRAS对照的百分比变化G12C突变细胞系用100 °nm RM-018、1 °nm RMC-6272或组合处理72 °h。数据的平均值为 ± SDn = 8个实验重复。P显示了值，并通过单向ANOVA和事后Tukey检验进行计算。显示了遗传共改变的状态。
我们观察到用AZD8037处理后，细胞系中PI3K/mTOR的抑制显著不同 (图。
2a,补充图。
2a)。在敏感细胞系中，我们观察到mTORC1底物p-p70S6K T389和p4EBP1 S65在24 °h持续抑制，而pAKT S473在较早的时间点被抑制，但在24 °h有反弹的迹象。相比之下，中间和抗性细胞系不表现出对p4ebp1s65的抑制，而对p-p70S6K T389的抑制较弱，而pakts473表现出不同的动力学，在某些细胞系中具有初始抑制，然后是强反弹。这些数据表明，PI3K/mTOR信号传导的抑制，特别是4EBP1磷酸化的抑制，与这些肿瘤中的RAS抑制剂功效密切相关。使用活动状态的RAS观察到类似的模式G12C抑制剂RM-018 (补充图。
2b)。
为了提供该观察的定量，我们进行了细胞生长的抑制与ERK和PI3K/mTOR信号传导的抑制之间的相关分析。我们发现非活性状态的KRAS对细胞生长的抑制作用G12C抑制剂sotorasib和AZD8037与pAKT S473，p-p70S6K T389和p4E-BP1 S65的抑制程度高度相关，具有R2值范围为0.53-0.77，而pERK抑制与
右2值为0.11 (图。
1a,图。
2b,补充图。
2a)。这项分析也是用RM-018进行的，观察到类似的相关性模式 (图。
1b,图。
2c,补充图。
2b)。这些结果表明KRAS抑制ERK信号传导G12C抑制剂是必需的，但不足以使细胞致敏; 还需要额外抑制PI3K/mTOR信号传导。这与以前的报道以及我们以前的发现一致，即抗增殖功效需要4E-BP1的去磷酸化及其对帽依赖性翻译的抑制。
15。当时，这是通过将MEK抑制剂与AKT抑制剂组合来实现的，其各自抑制正常细胞和肿瘤细胞中的信号传导，然而发现这种组合在体内是不可耐受的。我们目前的数据和突变等位基因选择性RAS抑制剂的发展使我们重新审视了这一想法。
抑制PI3K/mTOR信号的变异性及其与敏感性的关联表明，这种关系可能是因果关系，并且将RAS抑制剂与更有效的PI3K或mTOR抑制剂结合使用可能会显着增强抗肿瘤活性。因此，我们测试了PI3K途径不同成分的抑制剂单独和与RAS抑制联合的作用 (图。
2d)。我们选择RM-018作为具有代表性的有效活跃状态RAS进行进一步分析。G12C抑制剂。对于PI3K/mTOR通路抑制剂，我们使用了BYL719，一种PI3K α 特异性抑制剂，MK2206，一种变构泛AKT抑制剂，雷帕霉素，一种变构mTOR抑制剂，优先抑制mTORC1，但弱4E-BP1磷酸化抑制剂和两种第三代有效的mTOR双位阻抑制剂: rapaLink-1和RMC-6272都是双位阻抑制剂，由与mTOR激酶的ATP竞争性抑制剂共价连接的雷帕霉素样部分组成。
21,
22,
23。与Rapalink-1相比，RMC-6272对mTORC1具有相对选择性，同时在相当大的浓度范围内保留mTORC2 (补充图。
2c, d)，而两者都能有效抑制KRAS中的4E-BP1磷酸化G12CNSCLC细胞
21。RMC-6272是一种临床前工具化合物，代表研究药物RMC-5552。选择性双空间mTORC1抑制剂保留抗肿瘤活性，但不会在临床前模型中引起高血糖
23。
我们观察到PI3K抑制，AKT抑制和雷帕霉素对面板中细胞的增殖具有适度的影响，与72 °h的对照相比，细胞生长平均减少20-40% (图。
2d)。然而，双空间mTOR抑制剂Rapalink-1和RMC-6272明显更有效，平均减少大于50%。然后我们测试了这些抑制剂中的每一种与RM-018的组合。PI3K或AKT抑制与RM-018组合具有适度的附加益处。然而，将RM-018与mTOR抑制剂组合具有更显著的协同效应，其中双位mTOR抑制剂在整个细胞系模型中表现出大于80% 的平均生长减少。在每个测试的模型中，与单独的化合物相比，RM-018和RMC-6272的组合显示出细胞活力的显着降低，而与共突变状态无关 (图。
2e)。这些结果表明，在这个KRAS小组中G12C突变的NSCLC细胞系，特别是mTORC1抑制在与KRAS联合治疗的背景下是至关重要的G12C抑制剂。我们被鼓励在相关的临床前模型中进一步探索这种体内治疗策略。
我们首先测试了口服生物可利用的活性状态KRASG12C细胞系衍生的H2122 KRAS中的抑制剂RMC-4998和mTORC1-selective双空间抑制剂RMC-6272G12C肺腺癌异种移植模型 (CDX)。通过腹膜内注射每周一次施用RMC-6272，并且通过口服管饲法每天一次施用RMC-4998。当作为单一药物施用时，mTORC1抑制剂引起肿瘤生长的适度抑制，而KRASG12C抑制剂阻止生长约30-35天，之后肿瘤在治疗时开始生长。相比之下，RMC-4998与RMC-6272的组合导致几乎完全的肿瘤消退，在给药后不久开始并持续50天的治疗 (图。
3a)。该组合耐受性良好，没有体重减轻，并且抑制剂单药治疗和该组合在治疗4周内均未引起明显的高血糖症 (补充图。
3a, b)。我们还测试了研究候选人RMC-6291 (活动状态RASG12C抑制剂)
19和RMC-5552 (双空间mTORC1-selecive抑制剂)
23在H2122和H2030 CDX型号中 (图。
3b,补充图。
3c)。在H2122中，对RMC-6291和RMC-5552的反应，单独和组合，分别与它们的临床前工具化合物RMC-4998和RMC-6272非常相似。在H2030中，两种单一药物均导致肿瘤生长适度减慢，但在组合中，肿瘤消退随时间增加，直到第70天出现最小残留肿瘤。
aH2122异种移植物用媒介物、每周6 mg/kg RMC-6272、每天80 mg/kg RMC-4998或组合处理。从治疗开始对肿瘤体积作图 (平均 ± SEM，n = 每组5只小鼠)。P显示了值，并通过双侧t检验计算。bH2122异种移植物在植入后10天用载体处理，RMC-6291每天100mg/kg，每周RMC-5552 10mg/kg，或组合。从治疗开始，将肿瘤体积随时间作图 (平均 ± sem，每组中n = 8只小鼠)。P显示了值，并通过双侧t检验计算。c四种不同的KRASG12C将突变型肺PDX肿瘤植入NSG小鼠中。用媒介物处理pdx，每周RMC-6272 6 mg/kg，每天RMC-4998 80 mg/kg，或组合。从治疗开始的时间绘制肿瘤体积 (对于LX349和LX699，每个队列中平均 ± SEM，n = 5只小鼠，对于LX369和LX337，每个队列中n = 6只小鼠)。P显示了值，并通过双面计算t测试。d显示治疗结束时单个LX349 (左) 和LX369 (右) 肿瘤的肿瘤体积 (相对于初始体积) 的百分比变化的瀑布图。P显示了值，并通过单向ANOVA和事后Tukey检验进行计算。
然后，我们将这种联合治疗方法的研究扩展到一系列相对不敏感的KRASG12C具有各种共存遗传病变的突变型肺癌PDX模型 (突变体
TP53、STK11/LKB1、KEAP1,
MEK2) (图。
3c)。RMC-4998与RMC-6272的组合在四个模型中的三个模型中实现了显著的肿瘤缩小，在LX349和lx369中具有明显的协同作用。在所有携带LX349和LX369 PDX模型的荷瘤小鼠中都观察到这些反应 (图。
3d)，并在七周内耐用。在LX349中，两个KRASG12C抑制剂和组合是有效的，但对KRAS的抗性G12C抑制剂，而不是组合治疗组，在第40天发展。相比之下，两个KRASG12C抑制剂和mTORC1抑制剂在LX369中仅引起轻微的生长延迟，但该组合在第40天引起完全的肿瘤消退，在第75天持续响应。有趣的是，LX699，唯一的模型，没有经历回归与组合，并在36天的治疗过程中缓慢增长，怀有一个
MEK2G214W突变，虽然以前未表征，但可能是该模型中KRAS抑制剂抗性的机制。在治疗时，没有一个模型对联合疗法产生抗性。在治疗期间，任何小鼠均未观察到明显的体重减轻 (补充图。
3d)。
我们希望进一步探索我们观察到的协同组合活性的机理基础。我们以前已经证明PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/ERK通路在关键的细胞过程中汇聚，包括细胞周期蛋白D-Cdk4/6激活和cap依赖性翻译，并且必须抑制这两种途径以影响肿瘤生长或存活
15,
24。在H1373和H2122中，处理24 °h后的RM-018和RMC-6272均导致G0/G1细胞增加约50%，同时S期细胞减少。然而，联合治疗产生了更深远的影响，G0/G1细胞增加110%，同时S期细胞减少 (图。
4a,补充图。
4a)。我们在H1373，H2122，HOP62和H2030细胞系中研究了这种现象的潜在机制。在这些模型中，每种抑制剂单独引起细胞周期蛋白D1蛋白水平的适度降低，而视网膜母细胞瘤 (RB) 磷酸化的显着降低 (图。
4b,补充图。
4b)。相比之下，该组合引起细胞周期蛋白D1和磷酸化RB蛋白水平的显著降低。为了进一步评估细胞周期蛋白D1的功能重要性，我们在H1373细胞中进行了细胞周期蛋白D1的siRNA敲除，并观察到这足以降低RB磷酸化并抑制细胞增殖，其程度与RM-018和RMC-6272的组合相似 (补充图。
4c, d)。此外，细胞周期蛋白D1敲低足以引起周期停滞，G0/G1细胞增加3倍，S期细胞减少80% (补充图。
4e)。
a用1 μ nm RMC-6272、100 μ nm RM-018或组合处理H1373细胞24 μ h。用基于edu-dapi的流式细胞术检测细胞周期状态。b将H1373和H2122细胞用100 μ nm RM-018、1 μ nm RMC-6272或组合处理指定时间，并通过免疫印迹分析裂解物。c蛋氨酸饥饿实验的流程图 (d)。d将H1373细胞在蛋氨酸饥饿的培养基中培养24 ° h，然后单独加入完全培养基 (CM)，或加入1 ° nm RMC-6272或50 μ g/ml环己酰亚胺 (CHX) 对于指定的时间，通过免疫印迹分析裂解物。e在1 °nm RMC-6272、100 °nm RM-018或组合24 °h后，通过定量PCR在H1373、HOP62、H2030和H2122细胞中测定细胞周期蛋白D1的mRNA水平。显示的数据代表n = 3个实验重复的平均值 ± SD。P显示了值，并通过单向ANOVA和事后Tukey检验进行计算。
由于细胞周期蛋白D1翻译依赖于mTORC1
25,我们评估了它是否受到RMC-6272的影响。我们使细胞饥饿24 °h以抑制翻译的起始，然后在24 °h后用含或不含RMC-6272的完全培养基重新培养细胞 (图
4c)。使用全局翻译抑制剂环己酰亚胺作为阳性对照。蛋氨酸剥夺降低了细胞周期蛋白D1的蛋白水平，而mRNA水平没有明显抑制 (图。
4d,补充图。
4f)。一旦加入完全培养基，细胞周期蛋白D1蛋白水平立即恢复，而RMC-6272抑制了这种增加 (图。
4d)。这些数据表明RMC-6272主要通过阻断其翻译来抑制细胞周期蛋白D1蛋白表达的诱导。然而，我们注意到单独的RMC-6272不能完全抑制细胞周期蛋白D1的表达，因此评估了RM-018，RMC-6272或组合是否影响细胞周期蛋白D1 mRNA的水平。在四个细胞系模型中，RMC-6272处理后细胞周期蛋白D1 mRNA水平增加了约50-100%，而RM-018处理则抑制了约50-75% (图。
4e)。联合治疗也将细胞周期蛋白dlmrna抑制到与单独RM-018大致相同的水平，证明RM-018的作用在这种情况下占主导地位。总之，这些结果表明RMC-6272对细胞周期蛋白D1翻译的影响被细胞周期蛋白D1 mRNA的ERK依赖性诱导所缓冲。RM-018和RMC-6272的组合阻断两个过程并协同降低细胞周期蛋白D1蛋白水平。
KRAS的体内消退G12CNSCLC鼠模型表明组合疗法诱导细胞死亡。我们询问mTORC1抑制是否增强KRASG12C抑制剂诱导的细胞毒性。KRAS中的死亡诱导G12C在用RM-018、RMC-6272或组合处理72小时后，用膜联蛋白V-碘化丙啶 (PI) 测定评估突变体H1373、H2122和HOP62细胞系。在H1373，H2122和HOP62中，单独的RM-018使膜联蛋白V阳性细胞的百分比增加了大约一倍，而RMC-6272仅引起最小的增加 (图。
5a,补充图。
5a)。然而，与单独的RM-018处理相比，与RMC-6272的组合与对照相比显著地将总细胞死亡增加了三至四倍。在H1373和H2122细胞中，泛半胱天冬酶抑制剂z-vad-fmk (z-vad) 在不同程度上抑制了该组合诱导的死亡，表明死亡的很大一部分是由于胱天蛋白酶裂解级联的激活，但也可能涉及其他机制 (补充图。
5b)。与膜联蛋白v-pi测定的结果一致，与单独的RM-018相比，抑制剂组合诱导了裂解的PARP的显著时间依赖性增加 (图。
5b)。值得注意的是，单独的细胞周期蛋白D1敲低不会诱导切割的PARP或增加膜联蛋白V阳性细胞的百分比 (补充图。
5c)。
a用100 °nm RM-018、1 °nm RMC-6272或组合处理H1373细胞72 °c，并通过FACS分析以定量膜联蛋白V阳性细胞。对于n = 3个实验重复，数据为均值 ± SD。
P显示了值，并通过单向ANOVA和事后Tukey检验进行计算。b来自用100 °nm RM-018、1 °nm RMC-6272或组合处理指定时间的H1373和H2122细胞的裂解物的免疫印迹分析。c将H1373细胞在蛋氨酸饥饿的培养基中培养24 °h，然后单独用完全培养基 (CM) 或1 °nm RMC-6272或50 μ g/ml环己酰亚胺 (CHX) 代替。对于指定的时间，通过免疫印迹分析裂解物。d用靶向BIM、PUMA或scramble (scr) siRNA的siRNA转染H1373细胞并孵育24 °c。然后将细胞用1 ° nm RMC-6272和100 ° nm RM-018的组合处理48小时，并通过免疫印迹分析裂解物。e用100 °nm RM-018、1 °nm RMC-6272或组合处理用GFP对照或表达慢病毒质粒的MCL-1感染的H1373细胞48小时，并通过免疫印迹分析裂解物。f用载体处理H2122-derived异种移植物，RMC-6272 6 °c/kg一次，RMC-4998 80 °c/kgx2剂量，间隔24小时，或组合。处理开始后48小时，收集肿瘤，裂解并用所示抗体进行免疫印迹。M1、M2、M3代表来自每个处理条件的个体小鼠。g用媒介物、RMC-5552 (10 °mg/kg，ip) 、RMC-6291 (100 °mg/kg，po) 或组合处理后8小时收集的H2122-derived异种移植肿瘤的IHC分析。所有IHC载玻片的放大倍数为40x，比例尺为100 μ m。h切割的半胱天冬酶3 IHC分析的定量显示在 (
g)。显示的数据代表n = 3个实验重复的平均值 ± SD。
仅BH3结构域蛋白如BIM，PUMA和BID与BCL2家族成员如MCL-1的结合抑制后者的抗凋亡作用并诱导凋亡
26。MCL-1翻译以前被证明是依赖于mTOR的
27,
28。因此，我们进一步研究了mTORC1抑制对MCL-1翻译的影响是否是与KRAS组合增强细胞死亡的基础。G12C抑制剂。我们发现RMC-6272降低了MCL-1蛋白水平，这与以前的研究一致，但单独使用不会诱导PARP切割 (图。
5b)。蛋氨酸剥夺后MCL-1蛋白水平降低，加入完全培养基后恢复，而RMC-6272阻止了这种恢复 (图
5c)。相反，蛋氨酸饥饿诱导了MCL-1的mRNA水平，表明蛋白质水平的降低是由于MCL-1翻译的抑制 (补充图
5d)。另一方面，RM-018对MCL-1蛋白水平影响不大，但强烈诱导促凋亡BH3-only蛋白BIM和PUMA (图。
5b)。抑制BIM的ERK依赖性磷酸化可稳定后者，并导致蛋白质表达增加
29。在H2122中，与单独的RMC-6272处理相比，RM-018的添加进一步降低了MCL-1蛋白水平。作为这一观察结果的可能机制，先前已报道磷酸化的BIM结合并稳定MCL-1
30。
从这些数据中，我们假设通过联合抑制KRAS诱导细胞凋亡G12CmTORC1部分是由于后者对MCL-1翻译的抑制和前者对BIM和/或PUMA蛋白表达的诱导。因此，我们用siRNA敲除MCL-1 (补充图。
5e)，并发现与RM-018抑制作用合作足以增强H1373，H2122和HOP62细胞系中的caspase3/7活性 (补充图。
5f)。此外，BIM的siRNA敲低，而不是PUMA，通过KRAS的联合抑制显着降低了PARP切割的诱导G12C和H1373细胞中的mTORC1 (图。
5d)。这表明在这些细胞中，BIM是诱导凋亡所必需的，而PUMA是可有可无的。MCL-1过表达也阻止了该组合对PARP裂解的诱导，表明这些细胞中的MCL-1足以抑制细胞凋亡 (图。
5e)。在用RMC-4998和RMC-6272给药后48小时，我们在体内H2122异种移植肿瘤中证明了类似的作用。该组合有效抑制细胞周期蛋白D1和MCL-1蛋白水平，以及4E-BP1磷酸化 (图。
5f)。正如预测的那样，免疫组织化学分析表明，临床候选者的组合RMC-6291 (活性状态KRASG12C抑制剂) 和RMC-5552 (双位mTORC1-selective抑制剂) 类似地协同诱导半胱天冬酶3裂解 (图。
5g, h,补充图。
5g)，将我们的发现扩展到正在进行临床评估的研究药物。
总之，这些数据表明KRAS的BIM感应G12C通过mTORC1抑制对MCL-1蛋白翻译的抑制和阻断一起对于诱导组合治疗的抗肿瘤活性所需的细胞死亡是重要的。
KRASG12C抑制和mTORC1抑制导致帽依赖性翻译的协同减少我们先前已经证明AKT和MEK抑制协同抑制4E-BP1磷酸化，并且4E-BP1的去磷酸化是该组合的抗肿瘤活性所必需的。
15eIF4E识别mRNA m7GTP 5 ′ 帽结构，并组装eIF4F翻译起始复合物，该复合物还包括蛋白质eIF4A和eIF4G
31。4E-BP1与eIF4E的结合抑制了复合物的组装，而mTORC1对4E-BP1的磷酸化释放了eIF4E并允许帽依赖性翻译进行
32。因此，RMC-6272通过有效抑制mTORC1对4E-BP1的磷酸化来减弱帽依赖性翻译起始 (图。
4b,补充图。
2c-d)。
与5' 帽结构m7GTP缀合的珠能够从H1373和H2122细胞系的裂解物中下拉eIF4G、eIF4A和eIF4E。正如预期的那样，eIF4E/eIF4G相互作用通过敲低eIF4E而减少，从而抑制了翻译起始复合物的形成 (补充图。
6a)。在H1373和H2122模型中，单独的eIF4E敲低对细胞凋亡的影响很小，而用RM-018处理这些细胞会导致膜联蛋白V + 细胞增加大约两倍 (图。
6a)。这些结果表明，RMC-6272通过抑制4E-BP1磷酸化的作用与敲低eIF4E的作用相似，两者均导致eIF4F翻译起始复合物组装的抑制。单独使用都不会引起细胞凋亡，但是，eIF4E的敲低或RMC-6272治疗与KRAS合作G12C抑制诱导显著的细胞死亡。与这一机制一致，eIF4E的敲低抑制了H1373细胞中MCL-1和细胞周期蛋白D1的表达，在H2122细胞中程度较低 (图。
6b)。将RM-018与eIF4E敲低组合导致比单独的任一个更大的细胞周期蛋白D1和MCL-1两者的表达抑制。S6K磷酸化由eIF4E的敲低诱导，而其被RM-018抑制。S6K通过其他翻译调节剂如eIF4B和PDCD4影响eIF4A的解旋酶活性
33。因此，如用RMC-6272观察到的，4E-BP1和S6K磷酸化的双重抑制可能有助于抑制帽依赖性翻译。
a用靶向eIF4E或scramble (scr) siRNA的两种不同siRNA转染H1373和H2122细胞并培养24小时。用或不用100 ℃ 的RM-018替换培养基，并将细胞处理另外48小时，并通过FACS分析以定量膜联蛋白阳性细胞。对于n = 3个实验重复，数据为均值 ± SD。P显示了值，并通过单向ANOVA和事后Tukey检验计算。b用靶向eIF4E或scramble (scr) siRNA的两种不同siRNA转染H1373和H2122细胞并培养24小时。用或不用100 ℃ 的RM-018替换培养基，并将细胞再处理48小时，并通过免疫印迹分析裂解物。c用1 °nm RMC-6272，100 °nm RM-018或组合处理H1373和H2122细胞指定的时间，然后与m孵育7通过与全细胞提取物 (输入) 平行的免疫印迹探测GTP缀合的珠和裂解物。d将H2122细胞用100 μ m z-vad-fmk，1 μ nm RMC-6272，100 μ nm RM-018或指定组合处理48小时，并通过免疫印迹分析裂解物。
我们评估了RM-018和RMC-6272联合处理对H1373和H2122细胞系中帽依赖性翻译起始复合物形成的影响。正如预期的那样，RMC-6272处理后4E-BP1与eIF4E的结合增强，导致eIF4F复合物组装的抑制 (图。
6c)。eIF4F组装被进一步抑制。我们观察到总eIF4G的表达被H1373中的组合降低，而KRASG12C在h2122中抑制是足够的。eIF4G具有半胱天冬酶位点，并且可以在细胞凋亡期间被caspase-3切割
34。Z-vad通过组合防止eIF4G表达的丧失，表明通过组合处理包括caspase-3在内的半胱天冬酶的激活也诱导eIF4G的切割 (图。
6d)。因此，我们得出结论，通过抑制翻译和诱导BIM诱导细胞凋亡会导致前馈环，从而通过eIF4G降解进一步抑制翻译。这可能有助于KRAS的抗肿瘤作用G12C单独的抑制剂或与mTORC1抑制组合。
讨论非活动状态KRAS的总体响应率G12Csotorasib和adagrasib抑制剂在患者中的应用
KRASG12C突变型NSCLC为37-43%，这是一个重大进步，尽管有很大的改善空间
7,
8。我们研究了一类活动状态的RASG12C与丰富的细胞内蛋白亲环素a和与GTP结合的KRAS形成三复合物的抑制剂G12C形成共价键的
19。我们证明了这一类的代表性化合物，RM-018和RMC-4998，比目前的非活性状态KRAS更有效。G12C抑制剂在所研究的NSCLC细胞系模型的重要亚组中，与分化的作用机制一致。我们进一步表明，与非活动状态的KRAS相比，RM-018导致更有效的ERK输出抑制和更少的反馈再激活。G12C抑制剂。
然而，即使对该途径有更有效的抑制作用，我们仍然观察到对活性状态RAS反应的显着异质性。G12C一组NSCLC细胞系模型中的抑制剂。虽然以前的研究已经描述了对KRAS的获得性抗性G12C抑制和鉴定的因果突变和非遗传机制，包括RTK激活和上皮-间质转化
11,
12,
13,
14,
35,对KRAS敏感性差异的潜在机制G12C抑制作用不太了解。在本研究中，我们的数据表明，对KRAS的敏感性之间存在很强的相关性。G12C抑制和PI3K/mTOR途径抑制的程度，特别是包括4E-BP1和S6K的mTORC1靶标的抑制。这种相关性对于对活动状态KRAS的敏感性持续存在G12C抑制剂，表明即使更有效地抑制KRASG12C,一些细胞有固有的KRASG12C-独立的PI3K途径激活。我们确定了三种类型的细胞系: 1) ERK和PI3K信号均被KRAS有效抑制的细胞系G12C抑制剂，2) 两者都不是的抑制剂，以及3) ERK信号敏感而PI3K信号较少且变化敏感的抑制剂。这种现象的机制基础尚不清楚，但我们推测在第三组细胞中，PI3K/mTOR信号可能完全是KRAS。G12C-独立的，或由突变体和突变体非依赖性途径两者驱动。后者可以包括通过野生型RAS机制的激活。另一层复杂性是两个途径之间的交叉调节，其中ERK信号传导进入PI3K/mTOR的几个节点，例如其对TSC2的磷酸化。
36,
37,
38。然而，这些数据与我们先前的发现一致，即抑制ERK和PI3K/mTOR信号失调的肿瘤生长需要抑制这两种途径。
15,
24。
因此，我们测试了PI3K通路单个组分的抑制剂是否影响KRAS的生长抑制或诱导细胞死亡。G12C抑制剂。PI3K、AKT和mTOR激酶抑制剂均与KRAS协同作用G12C不同程度的抑制，mTORC1激酶抑制剂最有效。这些数据支持我们的研究结果的机制重要性，即KRAS的抗肿瘤活性G12C抑制剂与PI3K/mTOR途径抑制密切相关，尤其是抑制mTORC1底物4E-BP1和S6K的磷酸化。这些数据与我们以前的发现一致，即4E-BP1是PI3K/AKT/mTOR和RAF/MEK/ERK通路的趋同靶标，并在cap依赖性调节水平上整合了它们的功能。翻译
15。其他小组先前的研究也证明了mTORC1抑制对于MAPK或PI3K-pathway定向疗法在包括肺，乳腺和黑色素瘤在内的多种肿瘤类型中的有效性的重要性。
39,
40,
41,
42。我们的数据现在进一步表明，联合抑制KRAS的可能性G12CmTORC1可能对治疗KRAS有用G12C突变型非小细胞肺癌。以前的策略结合MEK和AKT抑制被证明是耐受性差，不适合治疗患者
43,
44。在本研究中，我们利用了双空间mTORC1-selective抑制剂RMC-6272，与PI3K，AKT和变构mTORC1抑制剂相比，其与RAS抑制的协同作用最强。我们认为MEK抑制剂的替代，抑制正常和肿瘤细胞中的ERK信号传导，并且具有狭窄的治疗指数，突变选择性RAS抑制剂和mTORC1-selective激酶抑制剂的使用可以允许在人类中安全施用该组合。
我们测试了KRAS的联合抑制G12C和mTORC1在体内，并在各种CDX和PDX模型中观察到惊人的抗肿瘤活性
KRASG12C具有多种共突变的突变型NSCLC。这些反应在几乎所有情况下都与深度消退相关，并且明显持久。我们观察到这种联合治疗的动物体重减轻最小，并且没有高血糖症，而高血糖症是靶向mTORC2的PI3K/mTOR途径抑制剂的先前靶向不良反应。
45。这些数据表明，KRAS的组合G12C抑制剂与mTORC1-selective抑制剂是一种有前途的治疗策略，广泛的KRAS子集G12C突变肺癌值得进一步研究。
我们以前已经表明，一些下游过程受ERK和PI3K/mTOR信号的控制，并且它们的有效抑制需要抑制这两种途径。
15,
24。抑制PI3K/mTOR或ERK信号传导通常会减轻对方的反馈抑制并导致其激活
46,
47。以这种方式，抑制ERK或PI3K信号传导的作用通过肿瘤和正常细胞中另一途径的再活化而得到缓冲。我们使用了KRASG12C探索抑制剂对KRAS的影响G12C肿瘤模型中的激活，并确定了由突变KRAS激活的三个关键细胞过程，其有效抑制需要抑制PI3K/mTOR和ERK信号传导: 细胞周期蛋白D1表达，细胞存活，和cap依赖翻译。mTORC1的抑制抑制了细胞周期蛋白D1的翻译，但也诱导了细胞周期蛋白D1 mRNA的表达，从而减弱了前者的作用。需要两者的联合抑制以使细胞周期蛋白D1抑制和细胞周期停滞最大化。相反，该机制表明，通过激活PI3K和ERK信号，突变的KRASG12C放大细胞周期失调。尽管mTORC1抑制减少了MCL-1、存活蛋白和抗凋亡网络的其他元件的翻译，但其本身并不诱导显著的细胞死亡。KRAS对ERK的抑制作用G12C抑制剂仅诱导pro-apoptotic-BH3结构域蛋白，如BIM和PUMA，但其本身也不会诱导显著的细胞死亡。这为正常细胞和肿瘤细胞提供了安全机制，由此单独抑制任一途径不会导致细胞死亡。然而，两种途径的肿瘤特异性抑制提供了信号并引起显著的细胞死亡。同样，帽依赖性翻译对于转化的表型是必需的，我们以前已经证明，抑制帽依赖性翻译的PTEN的去磷酸化对于联合治疗起作用是必需的。
48。通常需要抑制这两种途径，但我们确实确定了其中KRAS的细胞系G12C单独的抑制对于最大抑制是足够的。这些原来是相同的细胞系，其中KRASG12C抑制本身最有效地抑制mTOR活性，大概是通过完整的串扰机制。有趣的是，虽然突变选择性KRASG12C抑制作用足以驱动肿瘤消退。在这样的体内模型中，需要该组合来维持持久的反应。
其他问题仍然存在，例如不同谱系和个体肿瘤中PI3K/mTOR信号传导的RAS依赖性程度的分子决定因素。PI3K突变在结直肠癌中相对常见，但很少有胰腺或肺KRAS突变肿瘤具有PI3K通路激活的遗传机制。关于这些肿瘤中细胞生存网络或翻译起始的调节的复杂性或其他共存基因突变的作用，仍有许多有待研究。总之，我们已经鉴定了NSCLC中突变型RAS抑制的重要特征，其说明了其在驱动这些肿瘤中的作用及其治疗性抑制的分子后果。我们已经确定了联合抑制mTORC1和突变KRAS的机制原理。G12C。本文所述的临床前数据结果支持该组合治疗策略在KRAS患者中的临床评估G12C突变驱动的非小细胞肺癌。
方法细胞培养和试剂肺癌细胞系NCI-H358、NCI-H2122、NCI-H2030、HCI-H1373、NCI-H1792、NCI-H23、HOP62、Calu-1和SW1573、A549购自美国典型培养物保藏中心。PC-9由Emily Cheng实验室 (MSKCC) 提供。HCC44获自韩国细胞系库。LU-65和LU-99A从日本细胞研究银行 (大阪，日本) 获得。NCI-H358、NCI-H2122、NCI-H2030、HCI-H1373、NCI-H1792、NCI-H23、HOP62、SW1573、LU-65和LU-99A细胞在RPMI1640中培养; A549在DMEM中培养; Calu-1在mccoy's5a中培养。所有培养基补充有2mm谷氨酰胺和10% 胎牛综合征。将所有细胞维持在37 °C、5% co2中。使用MycoAlert支原体检测试剂盒 (Lonza) 定期筛选细胞的支原体。Sotorasib、Adagrasib、BYL719、雷帕霉素、MK2206获自sellecchemical (Houston，TX)。AZD8037获自AstraZeneca。RapaLink-1购自MedChemExpress。RM-018，RMC-6272，RMC-4998，RMC-6291和RMC-5552由革命药物提供。将化合物溶解在DMSO中至10 °C/l的终浓度并储存在-20 °C。
细胞增殖分析对于细胞活力的剂量反应测定，2-3 × 103将细胞接种在96孔板的每个孔中并孵育过夜。然后用增加浓度的指定药物处理细胞72 °c。根据制造商的说明书，使用celltiter-glo发光细胞活力测定 (Promega，Madison，WI) 进行细胞活力测定。在spectramaxm5读板仪 (Molecular Devices) 上测量发光。使用GraphPad Prism (Ver.9.41) 以图形方式显示数据。
免疫印迹用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂 (piercechemical，thermofisherscientific) 的RIPA缓冲液 (cellsignalingtechnologies，#9803) 裂解细胞。将裂解物短暂超声处理并通过在4 °C下在18，407 °C下离心5分钟来澄清。收集上清液，并通过BCA试剂盒 (Pierce) 测量蛋白质浓度。
将异种移植肿瘤在SDS裂解缓冲液 (50 °mmtris-hclph7.4，10% 甘油，2% SDS) 中匀浆，并在95 °C下煮沸5分钟。然后将裂解物短暂超声处理，再次煮沸5 ℃，并通过在18，407 ℃ 下离心澄清。 g在室温下10 °min。收集上清液并使用BCA试剂盒 (Pierce) 测定蛋白质浓度。将蛋白质样品与适当体积的sds-page样品缓冲液混合，并在70 °C下孵育10 °C。
将等量的蛋白质 (20 μ g) 在nupagebis-tris蛋白质凝胶 (Invitrogen) 上电泳，然后转移到硝酸纤维素或PVDF膜 (bio-rad，thermofisherscientific) 上。在室温下封闭1 °C并在4 °C下与第一抗体孵育过夜之前。然后将膜与适当的第二抗体一起孵育，并通过使用ECL检测试剂 (thermofisherscientific，Millipore) 的化学发光进行检测。
从细胞信号技术获得并以1:1000稀释度使用的一抗: pERK (#4370)，ERK (#4696)，pAKT T308 (#2965)，pAKT S473 (#4060), AKT (#9272), p4EBP1 S65 (#9451), p4EBP1 T37/46 (#9459), 4EBP1 (#9452), p-p70S6K (#9234)，p70S6K (#34475)，pCRAF C338(#9427)，pMEK (#9154)，CyclinD1 (#55506)，ppRB (#8516)，MCL-1 (#5453)，BIM (#2933)，PUMA (#12450)，裂解PARP (#5625)，裂解Caspase-3 (#9661)，eIF4G (#2498)，eIF4A (#2013)，eIF4E (#2067)，pEIF4E (#9741)，肌动蛋白 (#4970)，bcl-xl (#2764)。KRAS第一抗体获自LSBio (# LS-C1765665)。使用iBright检测到信号™1000成像系统 (Thermo Fisher Scientific)。所有蛋白质印迹实验重复至少两次，并显示代表性结果。
m7GTP结合测定将细胞在裂解缓冲液 (50 °mm hepes-koh (pH 7.4)，2 °mm EDTA，10 °mm焦磷酸盐，10 °mm b-甘油磷酸盐，40 °mm NaCl，1% Triton X-100) 中匀浆，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂 (Pierce化学，thermofisherscientific)。将细胞提取物 (250 μ g蛋白质) 与50 μ l m7GTP-sepharose珠 (AC-155，janabioscience，Germany) 在旋转悬浮混合器中于4 ℃ 温育2小时。将珠子用裂解缓冲液洗涤三次，然后将结合的蛋白质与适当体积的sds-page样品缓冲液混合，并在70 °C下孵育10 °C。短暂离心后，将上清液在NUPAGE凝胶上电泳，并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并进行免疫印迹。
RAS活性测定使用活性RAS下拉和检测试剂盒 (thermofisherscientific) 进行Ras活化测定。为了鉴定RAS-GTP，根据制造商的方案，用Raf1的Ras-结合结构域 (RBD) 的GST-融合蛋白连同谷胱甘肽琼脂糖树脂免疫沉淀细胞裂解物。重复RAS活性测定至少两次，并显示代表性结果。
siRNA敲低将细胞以1-2 × 10的密度接种到6孔板中5细胞/井。24 °h后，用20 °nm靶向加针对BIM、PUMA、MCL-1、eIF4E、细胞周期蛋白D1 (Horizon Discovery) 的siRNA转染细胞，选择siRNA作为阴性对照no.1 (Invitrogen) 根据制造商的说明使用Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen)。通过蛋白质印迹分析确认敲低。
细胞活力和caspase 3/7活性测定根据制造商的方案，通过胱天蛋白酶-glo3/7测定系统 (Promega) 分析胱天蛋白酶3/7的活性。简单地说，2 × 103将细胞接种在96孔板的每个孔中并孵育过夜。用siRNA MCL-1或乱序siRNA转染细胞并培养24 °c。然后，用或不用100 ℃ 的RM-018替换培养基，并将细胞再处理24 ℃。在实验结束时，将相同体积的半胱天冬酶-gl03/7试剂加入96孔板中，并在室温下在黑暗中孵育1 °c。在spectramaxm5读板仪 (Molecular Devices) 上测量发光。处理进行8次 (n = 8)。使用graphpadprism (Ver.9.0) 以图形方式显示数据。
MCL-1的过度表达GFP和MCL-1表达构建体获自Horizon发现。为了产生慢病毒，将质粒与包装质粒pMD2.G (addgene质粒 #12259) 和psPAX2 (addgene质粒 #12260) 瞬时共转染到293t细胞中。使用Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)。48 °c后，收获含有慢病毒的上清液并用0.45-μ mpvdf过滤器过滤。在5 mg/mL聚能胺的存在下用慢病毒转导靶细胞48小时。在另外的3天培养后，使用5 μ g/ml的basticidin进行选择。
实时PCR根据制造商的方案，使用rneasyplus迷你试剂盒 (Qiagen，Germantown，MD) 进行RNA提取。互补DNA (cDNA) 通过逆转录PCR从RNA合成，使用RNA到cDNA生态干燥™根据制造商的方案，使用TaqMan快速高级主混合物 (Invitrogen) 进行预混物 (TAKARA) 和实时PCR。在abi7500实时定量PCR系统上运行一式三份PCR反应。(应用生物系统) 和2-ΔΔ方法用于比较Ct。GAPDH用作这些计算的内部对照。
基于edu-dapi的流式细胞术5-10 × 105将细胞铺板于10 °c培养皿中，并用DMSO、1 °nm RMC-6272、100 °nm RM-018或组合处理24 °c。在收获之前，将细胞与10 °μmedu一起孵育2 °h。收获细胞并根据制造商的方案用click-itedualexafluor 488流式细胞术测定试剂盒 (Invitrogen) 染色。在cytekaurora (Cytek) 流式细胞仪上获得数据，并用FlowJo软件 (11.2版，bdbiosciences) 分析。门控策略是使用初步的ssc-a和fsc-a门，然后是ssc-h和ssc-w，然后是fsc-h和fsc-w。通过阴性和阳性对照确定门控边界。
膜联蛋白V-碘化丙啶 (PI) 测定5-10 × 105将细胞接种在10 ℃ 培养皿中，并用DMSO、1 ℃ RMC-6272、100 ℃ RM-018或组合处理。72 °h后，将培养基中的漂浮细胞和贴壁胰蛋白酶处理的细胞收集在单管中，并使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I (BD生物科学) 用膜联蛋白V和碘化丙啶染色根据制造商的协议。在cytekaurora (Cytek) 流式细胞仪上获得数据，并用FlowJo软件 (11.2版，bdbiosciences) 分析。门控策略是使用初步的ssc-a和fsc-a门，然后是ssc-h和ssc-w，然后是fsc-h和fsc-w。通过阴性和阳性对照确定门控边界。
异种移植研究对于CDX实验，使用无胸腺菌株 #007850 6-10周龄雌性小鼠。对于PDX实验，使用NSG菌株 #005557 6-10周龄雌性小鼠。一旦平均肿瘤体积达到约100-150 °mm3,将小鼠随机分组，并用两种载体，RMC-4998 (80 μ mg/kg，每天一次，每周5次，口服管饲)，RMC-6272 (6 μ mg/kg，每周一次，IP)，或与单一疗法相同剂量的这些药物的组合。同样，将小鼠随机分组，用RMC-6291 (100 μ mg/kg，每日一次，口服管饲)，RMC-5552 (10 μ mg/kg，每周一次，IP)，或与单一疗法相同剂量的组合。当最大肿瘤体积为1500毫米时，处死所有小鼠3达到了。
由不知道研究目的的研究技术人员使用卡尺以非盲方式每周两次测量肿瘤，并将其体积计算为宽度2 × 长度 × 0.5。每周两次监测体重。根据MSK动物护理和使用委员会批准的方案进行在纪念斯隆凯特林 (MSK) 进行的动物实验。对于在药明康德和Pharmaron进行的研究，所有动物实验均按照当地动物护理和使用委员会批准的方案进行。
免疫组织化学使用10% 中性缓冲福尔马林将所有组织固定长达24 °c，然后移至70% 乙醇中进行长期储存。使用Leica BOND III自动染色仪对4-μm组织切片进行所有IHC染色。用Leica结合聚合物检测试剂盒检测一抗。用3dhistotech全景全载玻片扫描仪在40x放大倍数下扫描和数字化染色的载玻片。使用来自Indica实验室的HALO软件进行图像分析。使用HALO的组织分类器模块对肿瘤和基质区域进行分类，并且仅在注释的肿瘤区域中定量标记。使用来自细胞信号传导技术的以下一抗，pERK (#4370，1:1000稀释) 、p4E-BP1 (#2855，1:1500稀释) 、p6RP (#5364，1:400稀释)，Ki67 (#12202S，1:1000稀释) 和切割的半胱天冬酶3 (#9661，1:400稀释)。Leica聚-HRP用作第二抗体。
统计学和再现性来自rt-pcr，流式细胞术和Caspase 3/7活性测定的数据表示为均值 ± 标准差 (SD)，动物研究中的肿瘤进展表示为均值 ± 标准差 (SE)，分别。学生的
t使用GraphPad Prism版本9.00 (GraphPad软件，La Jolla，CA，USA，
www.graphpad.com) 如图图例所示。
P值 < 0.05被认为是显著的。图中的星号表示显著性，如图例中详述。基于预期效应大小和确定显著性所需的统计功效来确定样本大小。没有数据被排除在分析之外。小鼠实验如所述进行随机化。在至少两个独立实验中重复蛋白质印迹。
提升卡
置顶卡
沉默卡
喧嚣卡
变色卡
千斤顶
显身卡
